Mosquitoes of eastern Amazonian Ecuador: biodiversity, bionomics and barcodes

Two snapshot surveys to establish the diversity and ecological preferences of mosquitoes (Diptera: Culicidae) in the terra firme primary rain forest surrounding the Tiputini Biodiversity Station in the UNESCO Yasuní Biosphere Reserve of eastern Amazonian Ecuador were carried out in November 1998 and May 1999. The mosquito fauna of this region is poorly known; the focus of this study was to obtain high quality link-reared specimens that could be used to unequivocally confirm species level diversity through integrated systematic study of all life stages and DNA sequences. A total of 2,284 specimens were preserved; 1,671 specimens were link-reared with associated immature exuviae, all but 108 of which are slide mounted. This study identified 68 unique taxa belonging to 17 genera and 27 subgenera. Of these, 12 are new to science and 37 comprise new country records. DNA barcodes [658-bp of the mtDNA cytochrome c oxidase ( COI ) I gene] are presented for 58 individuals representing 20 species and nine genera. DNA barcoding proved useful in uncovering and confirming new species and we advocate an integrated systematics approach to biodiversity studies in future. Associated bionomics of all species collected are discussed. An updated systematic checklist of the mosquitoes of Ecuador (n = 179) is presented for the first time in 60 years.

Circadian rhythms in insect disease vectors

Organisms from bacteria to humans have evolved under predictable daily environmental cycles owing to the Earth’s rotation. This strong selection pressure has generated endogenous circadian clocks that regulate many aspects of behaviour, physiology and metabolism, anticipating and synchronising internal time-keeping to changes in the cyclical environment. In haematophagous insect vectors the circadian clock coordinates feeding activity, which is important for the dynamics of pathogen transmission. We have recently witnessed a substantial advance in molecular studies of circadian clocks in insect vector species that has consolidated behavioural data collected over many years, which provided insights into the regulation of the clock in the wild. Next generation sequencing technologies will facilitate the study of vector genomes/transcriptomes both among and within species and illuminate some of the species-specific patterns of adaptive circadian phenotypes that are observed in the field and in the laboratory. In this review we will explore these recent findings and attempt to identify potential areas for further investigation.

Genetic Control of Mosquitoes: population suppression strategies / Controle genético de mosquitos: estratégias de supressão de populações

Over the last two decades, morbidity and mortality from malaria and dengue fever among other pathogens are an increasing Public Health problem. The increase in the geographic distribution of vectors is accompanied by the emergence of viruses and diseases in new areas. There are insufficient specific therapeutic drugs available and there are no reliable vaccines for malaria or dengue, although some progress has been achieved, there is still a long way between its development and actual field use. Most mosquito control measures have failed to achieve their goals, mostly because of the mosquito's great reproductive capacity and genomic flexibility. Chemical control is increasingly restricted due to potential human toxicity, mortality in no target organisms, insecticide resistance, and other environmental impacts. Other strategies for mosquito control are desperately needed. The Sterile Insect Technique (SIT) is a species-specific and environmentally benign method for insect population suppression, it is based on mass rearing, radiation mediated sterilization, and release of a large number of male insects. Releasing of Insects carrying a dominant lethal gene (RIDL) offers a solution to many of the drawbacks of traditional SIT that have limited its application in mosquitoes while maintaining its environmentally friendly and species-specific utility. The self-limiting nature of sterile mosquitoes tends to make the issues related to field use of these somewhat less challenging than for self-spreading systems characteristic of population replacement strategies. They also are closer to field use, so might be appropriate to consider first. The prospect of genetic control methods against mosquito vectored human diseases is rapidly becoming a reality, many decisions will need to be made on a national, regional and international level regarding the biosafety, social, cultural and ethical aspects of the use and deployment of these vector control methods.

Ao longo das duas últimas décadas, morbidade e mortalidade da malária e dengue e outros patógenos tem se tornado cada vez mais um problema de Saúde Pública. O aumento na distribuição geográfica de seus respectivos vetores é acompanhada pela emergência de doenças em novas áreas. Não estão disponíveis drogas específicas suficientes e não há vacinas específicas para imunizar as populações alvo. As medidas de controle de mosquitos atuais falharam em atingir os objetivos propostos, principalmente devido à grande capacidade reprodutiva dos mosquitos e alta flexibilidade genômica. O controle químico se torna cada vez mais restrito devido a sua potencial toxicidade aos seres humanos, mortalidade de organismos não alvos, resistência a inseticida além de outros impactos ambientais. Novas estratégias de controle são necessárias. A técnica do inseto estéril (SIT) é um método de supressão populacional espécie específico e ambientalmente amigável, baseia-se na criação em massa, esterilização mediante irradiação e liberação de um grande número de insetos machos. Liberar insetos carregando um gene letal dominante (RIDL) oferece uma solução a muitas limitações impostas pela técnica do inseto estéril (SIT) que limitaram sua aplicação em mosquitos e ainda assim mantém suas características de ambientalmente amigável e espécie específica. A natureza auto-limitante de mosquitos estéreis tende a deixar alguns empecilhos para uso no campo, de certa forma, menos desafiadores quando comparados a sistemas auto-propagação, característicos de estratégias de substituição de população. Sistemas auto-limitantes estão mais próximos para uso no campo, portanto pode ser apropriado considerá-lo primeiro. A perspectiva de métodos de controle genéticos contra mosquitos vetores de doenças que acometem humanos está rapidamente se tornando uma realidade, muitas decisões terão de ser tomadas em âmbito nacional, regional e internacional com relação a aspectos étnicos, sociais, culturais e de biossegurança para o uso e liberação destes métodos de controle de vetores.

Marcadores moleculares e controle genético de mosquitos vetores / Molecular markers and genetic control of the mosquito vectors

Os mosquitos são responsáveis pela transmissão de várias doenças ao homem, entre elas malária, dengue e filarioses. O Laboratório de Biologia Molecular de Vetores do Departamento de Epidemiologia da Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo vem desenvolvendo projetos de pesquisa relacionados aos aspectos moleculares e ao controle genético dos mosquitos vetores, principalmente dos gêneros Anopheles e Culex. A identificação das espécies contidas nesses gêneros é dificultada pela falta de características marcantes nas fêmeas adultas, e pelo fato de muitos desses pertencerem a complexos de espécies crípticas. Estes problemas levaram a utilização de abordagens moleculares, com a utilização de marcadores mitocondriais e ribossômicos para auxiliar na taxonomia e a responder questões filogenéticas. Entre os estudos discutidos nessa tese, é mostrado o Anopheles darlingi como espécie monotípica e o An. oswaldoi como um complexo de espécies. Já os estudos com espécies do gênero Culex indicaram a presença de alguns complexos e de espécies em processos de especiação. Sabe-se que a ocorrência de espécies crípticas entre os vetores de patógenos e o desenvolvimento de técnicas que permitam a correta identificação é crucial em programas de controle. O ressurgimento de parasitoses e arboviroses transmitidas por mosquitos devido principalmente a resistência desses aos inseticidas levaram ao surgimento de estratégias alternativas de controle, tais como a utilização de mosquitos geneticamente modificados para supressão ou substituição de populações vetoras. Embora a competência e a viabilidade da modificação genética de mosquitos tenham sido demonstradas em laboratório, ainda não se sabe como os transgenes podem ser inseridos nas populações de mosquitos na natureza. Foram propostas várias abordagens possíveis, como o uso de elementos de transposição. Porém, o êxito de qualquer mecanismo dependerá em parte do custo no fitness dos mosquitos que é imposto pela presença do transgene e, desse modo, estudos de fitness são essenciais para a seleção de linhagens de mosquitos transgênicos que poderão ser utilizadas em programas de controle.

Aplicação de marcadores microssatélites para o estudo de Culicidae (Diptera): revisão com especial referência a Haemagogus / Aplicación de marcadores microsatélites para el estudio de Culicidae (Diptera): una revisión con especial referencia a Haemagogus / Application of microsatellite markers for the study of Culicidae (Diptera): a review with special reference to Haemagogus

Marcadores moleculares microssatélites se caracterizam pela neutralidade, alto polimorfismo e elevada abundância com ampla distribuição pelo genoma de eucariotos. O seu emprego em estudos relacionados a espécies de mosquitos vetoras é ideal para o mapeamento genético e físico, para a identificação e discriminação de genótipos e estudos de genética de populações. Esta revisão sumariza e fornece informações sobre estudos envolvendo culicídeos através da utilização de marcadores microssatélites e propõe sugestões de pesquisas para uma melhor compreensão da biologia e dinâmica de transmissão do vírus da febre amarela por espécies do gênero Haemagogus.

Los marcadores moleculares microsatelitales se caracterizan por su neutralidad, alto polimorfismo y elevada abundancia con amplia distribución en el genoma de eucariotas. Su empleo en estudios relacionados a especies de mosquitos vectores es ideal para el mapeo genético y físico, para la identificación y discriminación de genotipos y estudios de genética de poblaciones. Esta revisión sintetiza y provee información sobre estudios de mosquitos que utilizan marcadores microsatelitales y propone nuevas líneas de investigación para una mejor comprensión de la biología y dinámica de transmisión del virus de la Fiebre Amarilla por especies del género Haemagogus.

Microsatellite molecular markers are characterized by neutrality, high polymorphism and wide distribution with high abundance in the genome of eukaryotes. Its use in studies related to species of mosquito vectors is ideal for genetic and physical mapping, for the identification and discrimination of genotypes and genetic studies of populations. This review summarizes and provides information on studies involving mosquitoes by using microsatellite markers and suggests avenues of research to better understand the biology and dynamics of transmission of Yellow Fever virus by Haemagogus mosquitoes.

Controle de vetores utilizando mosquitos geneticamente modificados / Control of vector populations using genetically modified mosquitoes

Formas químicas de controle de mosquitos vetores são ineficazes, levando ao desenvolvimento de novas estratégias. Assim, foi realizada revisão das estratégias de controle genético de populações de mosquitos vetores baseada na técnica do inseto estéril. Uma delas consiste na liberação de machos esterilizados por radiação, a outra, na integração de um gene letal dominante associado a um promotor específico de fêmeas imaturas. Entre as vantagens sobre outras técnicas biológicas e químicas de controle de vetores estão: alta especificidade, não prejudicial ao meio ambiente, baixo custo de produção e alta eficácia. O uso desta técnica de modificação genética pode vir a ser uma importante ferramenta do manejo integrado de vetores.

The ineffectiveness of current strategies for chemical control of mosquito vectors raises the need for developing novel approaches. Thus, we carried out a literature review of strategies for genetic control of mosquito populations based on the sterile insect technique. One of these strategies consists of releasing radiation-sterilized males into the population; another, of integrating a dominant lethal gene under the control of a specific promoter into immature females. Advantages of these approaches over other biological and chemical control strategies include: highly species-specific, environmentally safety, low production cost, and high efficacy. The use of this genetic modification technique will constitute an important tool for integrated vector management.

Variabilidade Genética em Populações de Aedes aegypti (L. ) (Diptera: Culicidae) Utilizando Marcadores de RAPD / Genetic Variability in Aedes aegypti (L. ) (Diptera: Culicidae) Populations Using RAPD Markers

Aedes aegypti (L.) é vetor de importantes doenças como a febre amarela e a dengue, presentes em regiões tropicais e subtropicais. Para o sucesso no seu controle biológico é importante conhecer a estrutura genética e os mecanismos que resultaram na diversidade das populações. O objetivo deste estudo foi analisar a variabilidade genética de diferentes populações de A. aegypti utilizando marcadores de RAPD (Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso). DNA de dez larvas coletadas a partir de três populações de diferentes localidades foi analisado usando dez iniciadores de RAPD. Os resultados indicaram a existência de variabilidade genética inter e intrapopulacional. Isso foi confirmado por um dendrograma que agrupou as populações em dois blocos principais com similaridade genética de 24 por cento. Em um desses agrupamentos foi possível distinguir duas populações que apresentaram grau de similaridade de 50 por cento. A diversidade genética entre as populações (55,01 por cento) foi mais elevada que a diversidade genética dentro das populações (44,99 por cento) aplicando-se análise por AMOVA. Altos níveis de polimorfismo genético (Ht = 0.2656) e de diferenciação genética entre as populações (Gst = 0.3689) foram observados. Além disso, o protocolo de extração de DNA adotado mostrou-se eficiente para a análise do inseto independente do seu estágio de desenvolvimento, evitando-se o acréscimo de reagentes ou etapas adicionais de processamento. Futuros experimentos poderão ser realizados para confirmar se a variabilidade observada pode estar ligada às características de resistência de cada população a um determinado pesticida.

Aedes aegypti (L.) is an important vector of diseases such as the yellow fever and dengue, present in tropical and subtropical regions. The objective of this study was to analyze the genetic variability of different A. aegypti populations using RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) markers as a basic study to support the use of biocontrol strategies. DNA of ten collected larvae from three different populations were analyzed using ten RAPD primers. The results indicated the existence of genetic variability inter and intrapopulation. This was confirmed by a dendrogram that grouped the populations in two main clusters with a genetic similarity of 24 percent. In one of these clusters, it was possible to distinguish two populations that showed 50 percent similarity. The molecular variance analysis indicated that the interpopulation genetic diversity (55,01 percent) was higher than the intrapopulation genetic diversity (44,99 percent). A high genetic polymorphism (Ht = 0.2656) and high levels of genetic differentiation between populations (Gst = 0.3689) were found. The adopted DNA extraction protocol proved to be efficient regardless the insect development stage used, avoiding the addition of reagents or additional stages of processing. Future experiments can be performed to confirm if the detected variability is related to the resistance characteristics of each population to a determined pesticide.

Análise de desempenho de mosquitos Aedes fluviatilis (Lutz, 1904) transgênicos expressando a fosfolipase A2 mutada do veneno de abelhas

A manipulação genética de insetos é uma alternativa às formas usuais de interferência, como por exemplo, o uso de inseticidas. Utilizando esta ferramenta podemos inserir, em insetos, genes que possuem a capacidade de bloquear parasitas. Estudos mostraram que a proteína fosfolipase A2 (PLA2) de venenos animais inibia a formação de ocistos de espécies de Plasmodium, se tornando uma ótima candidata para expressão em mosquitos transgênicos a fim de reduzir a transmissão do parasita. Contudo, ao expressar a PLA2 em mosquitos, observou-se que o desempenho biológico dos insetos foi prejudicado. A fim de contornar esse problema foram realizadas mutações no sítio ativo da enzima inativando-a, sem alterar sua capacidade de bloqueio de desenvolvimento de parasitas. Essa molécula de bloqueio (PLA2m) foi expressa em Aedes fluviatilis, vetor em laboratório do parasita causador da malária de aves. Ensaios prévios de avaliação de inibição do parasita e caracterização molecular das linhagens transgênicas (4T, 8T, 9T e 10T) não confirmaram se a PLA2m prejudicava o desempenho dos mosquitos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o desempenho biológico destes mosquitos. Fêmeas da linhagem 8T apresentaram longevidade significativamente maior que o controle; em machos, a longevidade das linhagens 8T, 9T e 10T foi maior que a do controle.

A fecundidade das fêmeas transgênicas foi igual à das fêmeas do grupo controle, porém a fertilidade das linhagens 4T, 8T e 10T foi menor (em porcentagem) que a do controle. A freqüência do transgene se manteve alta por várias gerações, mostrando que o mosquito transgênico se mantém persistente. Houve desvios de razão sexual nos transgênicos, quase sempre para maior proporção de machos. Não houve diferença significativa na susceptibilidade ao inseticida organofosforado Temefós entre as linhagens transgênicas e controle. Com relação à atividade das enzimas que detoxificam inseticidas, apenas a linhagem 4T apresentou atividade de acetilcolinesterase parcialmente alterada em relação ao controle. Entretanto, as outras linhagens mantiveram-se sensíveis. Para a alfa, beta e PNPA esterases, oxidases de função mista e glutationa S-transferase, todas as linhagens transgênicas mantiveram-se sensíveis. Podemos concluir que a PLA2m não interferiu nos parâmetros biológicos avaliados nos mosquitos transgênicos. Estes resultados a colocandom como uma forte candidata para ser expressa em mosquitos anofelinos vetores de parasitas da malária humana

Análise de desempenho de mosquitos Aedes fluviatilis (Lutz, 1904) transgênicos expressando a fosfolipase A2 mutada do veneno de abelhas / Performance Analysis mosquito Aedes fluviatilis (Lutz, 1904) transgenic expressing mutated phospholipase A2 from bee venom

A manipulação genética de insetos é uma alternativa às formas usuais de interferência, como por exemplo, o uso de inseticidas. Utilizando esta ferramenta podemos inserir, em insetos, genes que possuem a capacidade de bloquear parasitas. Estudos mostraram que a proteína fosfolipase A2 (PLA2) de venenos animais inibia a formação de ocistos de espécies de Plasmodium, se tornando uma ótima candidata para expressão em mosquitos transgênicos a fim de reduzir a transmissão do parasita. Contudo, ao expressar a PLA2 em mosquitos, observou-se que o desempenho biológico dos insetos foi prejudicado. A fim de contornar esse problema foram realizadas mutações no sítio ativo da enzima inativando-a, sem alterar sua capacidade de bloqueio de desenvolvimento de parasitas. Essa molécula de bloqueio (PLA2m) foi expressa em Aedes fluviatilis, vetor em laboratório do parasita causador da malária de aves. Ensaios prévios de avaliação de inibição do parasita e caracterização molecular das linhagens transgênicas (4T, 8T, 9T e 10T) não confirmaram se a PLA2m prejudicava o desempenho dos mosquitos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o desempenho biológico destes mosquitos. Fêmeas da linhagem 8T apresentaram longevidade significativamente maior que o controle; em machos, a longevidade das linhagens 8T, 9T e 10T foi maior que a do controle.

A fecundidade das fêmeas transgênicas foi igual à das fêmeas do grupo controle, porém a fertilidade das linhagens 4T, 8T e 10T foi menor (em porcentagem) que a do controle. A freqüência do transgene se manteve alta por várias gerações, mostrando que o mosquito transgênico se mantém persistente. Houve desvios de razão sexual nos transgênicos, quase sempre para maior proporção de machos. Não houve diferença significativa na susceptibilidade ao inseticida organofosforado Temefós entre as linhagens transgênicas e controle. Com relação à atividade das enzimas que detoxificam inseticidas, apenas a linhagem 4T apresentou atividade de acetilcolinesterase parcialmente alterada em relação ao controle. Entretanto, as outras linhagens mantiveram-se sensíveis. Para a alfa, beta e PNPA esterases, oxidases de função mista e glutationa S-transferase, todas as linhagens transgênicas mantiveram-se sensíveis. Podemos concluir que a PLA2m não interferiu nos parâmetros biológicos avaliados nos mosquitos transgênicos. Estes resultados a colocandom como uma forte candidata para ser expressa em mosquitos anofelinos vetores de parasitas da malária humana

Perspectives in the control of infectious diseases by transgenic mosquitoes in the post-genomic era: a review

Arthropod-borne diseases caused by a variety of microorganisms such as dengue virus and malaria parasites afflict billions of people worldwide imposing major economic and social burdens. Despite many efforts, vaccines against diseases transmitted by mosquitoes, with the exception of yellow fever, are not available. Control of such infectious pathogens is mainly performed by vector management and treatment of affected individuals with drugs. However, the numbers of insecticide-resistant insects and drug-resistant parasites are increasing. Therefore, inspired in recent years by a lot of new data produced by genomics and post-genomics research, several scientific groups have been working on different strategies to control infectious arthropod-borne diseases. This review focuses on recent advances and perspectives towards construction of transgenic mosquitoes refractory to malaria parasites and dengue virus transmission.

Genética molecular dos ritmos circadianos em mosquitos vetores (Diptera: Culicidae) / Molecular genetic of the circadian rhythms in mosquitoes vectors (Diptera: Culicidae)

Relógios biológicos são mecanismos endógenos de marcar a passagem do tempo e podem ser encontrados em animais, plantas, fungos e até organismos unicelulares. No modelo Drosophila, o mecanismo molecular que controla os ritmos circadianos (24 horas) funciona através de alças de retroalimentação negativa envolvendo alguns genes, sendo os principais: period, timeless, cycle e Clock. Os homólogos destes genes já foram encontrados em várias espécies de animais, apontando para uma origem ancestral comum. Mosquitos são vetores de diversos agentes causadores de doenças a humanos e animais, mas apesar da sua importância epidemiológica pouco se conhece sobre os mecanismos moleculares que controlam os ritmos de atividade e hematofagia neste grupo de insetos. O presente trabalho objetivou o estudo do relógio biológico circadiano em mosquitos, usando como modelos a espécie diurna Aedes aegypti e a noturna Culex quinquefasciatus. Os estudos moleculares foram sempre acompanhados de experimentos de monitoramento da atividade/repouso dos insetos. A primeira etapa...Os resultados apontaram para uma alta similaridade em regiões de timeless conhecidas como importantes em Drosophila para manutenção do relógio biológico, sugerindo conservação de sua função nos mosquitos. A segunda etapa...Após estudos...de period, timeless, cycle e Clock na cabeça de fêmeas de Ae. aegypti e Cx. quinquefasciatus. Os resultados sugerem que o relógio central funcione de forma muito semelhante nas duas espécies. Análise da expressão desses genes nos corpos decapitados das fêmeas de Ae. aegypti, entretanto, aponta para padrões diferentes de expressão em relação à cabeça. Foi analisado tembém o efeito da inseminação e da hematofagia na expressão dos genes de relógio em Ae. aegypti. Apesar de dados da literatura mostrarem que a inseminação e a alimentação com sangue (após inseminação), causam alteração no comportamento das fêmeas de mosquito, apenas a hematofagia parece exercer alteração significativa na...

Genética molecular dos ritmos circadianos em mosquitos vetores (Diptera: Culicidae) / Molecular genetics of circadian rhythms in vectors mosquitoes (Diptera: Culicidae)

Relógios biológicos são mecanismos endógenos de marcar a passagem do tempo e podem ser encontrados em animais, plantas, fungos e até organismos unicelulares. No modelo Drosophila, o mecanismo molecular que controla os ritmos circadianos (~24 horas) funciona através de alças de retroalimentação negativa envolvendo alguns genes, sendo os principais: period, timeless, cycle e Clock. Os homólogos destes genes já foram encontrados em várias espécies de animais, apontando para uma origem ancestral comum. Mosquitos são vetores de diversos agentes causadores de doenças a humanos e animais, mas apesar da sua importância epidemiológica pouco se conhece sobre os mecanismos moleculares que controlam os ritmos de atividade e hematofagia neste grupo de insetos. O presente trabalho objetivou o estudo do relógio biológico circadiano em mosquitos, usando como modelos a espécie diurna Aedes aegypti e a noturna Culex quinquefasciatusOs estudos moleculares foram sempre acompanhados de experimentos de monitoramento da atividade/repouso dos insetos. A primeira etapa da pesquisa compreendeu a obtenção em Ae. aegypti da seqüência codificante integral do gene homologo a timeless de Drosophila melanogaster e o estudo comparativo da seqüência do mesmo entre as duas espécies. Os resultados apontaram para uma alta similaridade em regiões de timeless conhecidas como importantes em Drosophila para manutenção do relógio biológico, sugerindo conservação de sua função nos mosquitos. A segunda etapa da pesquisa envolveu a determinação do padrão de expressão circadiana de period, timeless, cycle e Clock em mosquitos. Após estudos preliminares sobre a expressão de timeless e cycle em machos de Aedes aegypti, foram obtidas as curvas de expressão circadiana de period, timeless, cycle e Clock na cabeça de fêmeas de Ae. aegypti e Cx. quinquefasciatus. Os resultados sugerem que o relógio central funcione de forma muito semelhante nas duas espécies...

Biological clocks are endogenous time keeping systems that can be found in animals,plants, fungi and even unicellular organisms. In the Drosophila model, the molecularmechanism that controls the circadian rhythm (~24 hours) works through negative feedbackloops composed of a number of genes, among which the principal genes are: period, timeless,cycle and Clock. The homologues of these genes have been found in many animal species andtheir comparison points to a common ancestral origin. Mosquitoes are vectors of severalorganisms and viruses that cause diseases in humans and other animals, however despite theirepidemiological relevance not much is known about the molecular mechanisms controlling theiractivity rhythms and bloodfeeding behaviour. The purpose of the present work was toinvestigate the molecular regulation of the biological clock in mosquitoes, using as models thediurnal species Aedes aegypti and the nocturnal species Culex quinquefasciatus. Analysis of themosquitoes’ activity/rest behaviour was performed in parallel to the molecular studies. The firststage of this research was to obtain, in Aedes aegypti, the full coding sequence of the genehomologue to the timeless gene of Drosophila melanogaster and to perform comparativeanalysis between them. The results showed high similarities between the timeless gene of thetwo species, mainly in regions known, in Drosophila, to have a crucial involvement in theoperation of the biological clock, thus suggesting function conservation of the gene inmosquitoes. The second stage of the research involved the determination of the patterns ofexpression of the clock genes period, timeless, cycle and Clock in mosquitoes. After preliminarystudies of male Ae. aegypti, in which the temporal pattern of the expression of timeless and cyclewas determined, the circadian expression of period, timeless, cycle and Clock was characterisedin the heads of females of the species Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus...

Effect of temperature and insecticide stresses on Aedes aegypti larvae and their influence on the susceptibility of mosquitoes to dengue-2 virus.

Two major factors, higher temperatures and the application of insecticides, can drastically alter the genetic structure of a vector mosquito population. Due to these two stresses, the majority of the population gets wiped out, but the ones that withstand the stress and survive are likely to pass on survivability, and have an altered physiology. Our study shows that exposures to higher temperatures and DDT during the larval stage affects their susceptibility as adult mosquitoes to the DEN-2 virus. The overall transcription and translation status of heat shock protein (Hsp70) in virus high- and low-susceptible was the same as that in other batches. In the case of a DDT-resistant (R-7) strain two bands were obtained during RT-PCRs after heat shock. These two alleles were obtained only with HY-1 in which R-7 males were used for the crosses, suggesting that the second allele is probably male sex linked. The higher expression of Hsp70 may provide DDT-resistant strains a better chance of survival high temperature environments, particularly in homozygotes and hybrids. It was also interesting to note that these strains have a significantly lower susceptibility to the virus. Wide-spread DDT-resistance and a rise in temperature above the average temperature during summer may result in a population with a low susceptibility to the virus. Several families of heat shock proteins are known to be expressed in mosquitoes, and may have a cumulative role in determining susceptibility to the virus, which itself is governed by several genes.

Genealogia, distribuição e história de haplótipos do gene mitocondrial NADH 4 em populações do Aedes (Stegomyia) aegypti (Diptera: Culicidae) no Brasil / Genealogy, distribution and history of NADH4 haplotypes in Aedes (Stegomyia) aegypti (Diptera: Culicidae) populations from Brazil

Informações sobre variabilidade intrapopulacional de vetores biológicos são críticas para o entendimento da transmissão de agentes infecciosos veiculados por esses organismos. Nesse sentido, o presente trabalho caracterizou a variabilidade de fragmento que codifica a subunidade 4 do gene mitocondrial da Nicotinamina Adenina Dinucleotideo Desidrogenase - NADH4 em populações de Aedes aegypti do Brasil e de outros países. Polimorfismos de nucleotídeos únicos foram detectados através da técnica de seqüenciamento genômico. As análises realizadas compreenderam a de variância molecular (AMOVA), clados agrupados (NCA), distribuição de diferenças pareadas. Paralelamente foram examinadas relações evolutivas entre os haplótipos com o emprego dos critérios de parcimônia máxima e verossimilhança máxima. Os resultados mostram que há polimorfismo do fragmento nas populações analisadas, levando à proposição de dois clados geneticamente independentes (monofiléticos). Inferências de caráter histórico suportam a hipótese de que um dos clados inclui seqüências de indivíduos de populações que chegaram às Américas durante os séculos XVII e XVIII pelo tráfico negreiro, e outro, formado por populações introduzidas mais recentemente, se originou de populações asiáticas. Possíveis implicações epidemiológicas da variabilidade genética apresentada pelas populações do Ae. aegypti são também discutidas.

Knowledge about intrapopulacional variation of biological vectors is critical for understanding the dynamics of the transmission of an infectious agent. The major objective of the present study is to characterize the variability of a gene fragment, which codes for the subunit 4 of the mitochondrial gene of the Nicotinamide Adenine Dinucleotide Dehydrogenase - NADH4 among Aedes aegypti populations from Brazil comparing with that of several other countries. Single nucleotide polymorphism was detected employing genomic sequencing techniques. Nucleotide sequences were analyzed using molecular variance (AMOVA), nested clade (NCA) and mismatch distribution methods. Additionally, evolutionary relationships among haplotypes were estimated employing maximum parsimony and maximum likelihood criterions. The results show that the fragment of the mitochondrial gene (NADH4) is polymorphic, and that the populations of Ae. aegypti from Brazil are grouped into two genetically distinct, monophyletic clades Historical inferences support the hypothesis that one clade includes sequences from individuals that may be introduced in the Americas in the 17th and 18th centuries during the slave trade from Africa to America. The second clade consists of sequences of individuals that may be introduced in Brazil more recent, probably from Asian populations. Epidemiological consequences because of the genetic variability among populations of Ae. aegypti in Brazil are discussed.

Genealogia, distribuição e história de haplótipos do gene mitocondrial NADH4 em populações do Aedes (Stegomyia) aegypti (Diptera: Culicidae) no Brasil / Genealogy, distribution and history of haplotypes of the mitochondrial gene NADH4 among Aedes (Stegomyia) aegypti (Diptera: Culicidae) populations from Brazil

Informações sobre variabilidade intrapopulacional de vetores biológicos são críticas para o entendimento da transmissão de agentes infecciosos veiculados por esses organismos. Neste sentido, o presente trabalho caracterizou a variabilidade de fragmento que codifica a subunidade 4 do gene mitocondrial da Nicotinamina Adenina Dinucleotídeo Desidrogenase - NADH4 em populações de Aedes aegypti do Brasil e de outros países. Polimorfismo de nucleotídeos únicos foram detectados através da técnica de seqüenciamento genômico. As análises realizadas compreenderam a e variância molecular (AMOVA), clados agrupados (NCA), distribuição de diferenças pareadas. Paralelamente foram examinadas relações de parcimônia máxima e verossimilhança máxima. Os resultados mostram que há polimorfismo do fragmento nas populações analisadas, levando à proposição de dois clados geneticamente independentes (monofiléticos). Interferências de caráter histórico suportam a hipótese de que um dos clados inclui seqüências de indivíduos de populações que chegaram às Américas durante os séculos XVII e XVIII pelo tráfico negreiro, e outro, formado por populações introduzidas mais recentemente, se originou de populações asiáticas. Possíveis implicações epidemiológicas da variabilidade genética apresentada pelas populações do Ae. aegypti são também discutidas.

Psorophora columbiae and Psorophora toltecum (Diptera: Culicidae) Colombian populations cannot be differentiated by isoenzymes

Two populations of the mosquito Psorophora columbiae from the central Andean area of Colombia and one population of Ps. toltecum from the Atlantic coast of Colombia were analyzed for 11 isoenzyme markers. Psorophora columbiae and Ps. toltecum are two of the main vectors of Venezuelan equine encephalitis. We found no conspicuous genetic differences between the two species. The relatively high gene flow levels among these populations indicate that these are not two different species or that there has been recent divergence between these taxa. In addition, no global differential selection among the loci was detected, although the alpha-GDH locus showed significantly less genetic heterogeneity than the remaining loci, which could mean that homogenizing natural selection acts at this locus. No isolation by distance was detected among the populations, and a spatial population analysis showed opposite spatial trends among the 31 alleles analyzed. Multiregression analyses showed that both expected heterozygosity and the average number of alleles per locus were totally determined by three variables: altitude, temperature and size of the human population at the locality. Individually, the expected heterozygosity is more related to these three variables than to the average number of alleles

rDNA-ITS2 identification of Anopheles pulcherrimus [Diptera: culicidae]: genetic differences and phylogenetic relation with other Iranian vectors and its implications for malaria control

Anopheles pulcherrimus Theobald has a wide distribution in western Asia and is a potential vector of malaria in Iran. We have examined the rDNA-ITS2 [internal transcribed spacer 2] region of An. pulcherrimus specimens collected during the two peaks of activity [May-June and October-November] from Sistan and Baluchistan province, southeastern Iran. There were no consistent differences between specimens originated from different ecological areas. Total amplified fragment is 490 bp, which is within the range of the records repeated from other anophelines. ITS2 was 350 bp long in all individuals examined with identical sequence in different populations. Sequence analysis revealed its differences with two other important malaria vectors in the region, An. culicifacies and An. fluviatilis. However, based on ITS2-derived phylogenetic tree, the nearest taxa to An. pulcherrimus is a new species related to An. Culicifacies and called species X in An. culicifacies species complex. These data may provide a better understanding on dynamics of malaria transmission in southeastern corner of Iran and neighboring countries. Moreover, the extent of the genetic variation in these mainly sympatric species could result in designing and application of species-specific diagnostic tools, which can facilitate the management of malaria control program in the region

A new continuous cell line from the mosquito Psorophora confinnis (Diptera: Culicidae) and its susceptibility to infections with some arboviruses

A new cell line, PC-0199-BR, was established from embryonated eggs of the mosquito Psorophora confinnis. To date (September 2000) it has had 62 continuous passages. This is the first report of a cell line of mosquitoes belonging to the genus Psorophora. Cell growth initially was achieved in the MM/VP12 medium, supplemented with 20 percent fetal bovine serum; however, the subcultures were later adapted to Grace's medium with 10 percent fetal bovine serum. Cell morphology in the primary cultures was heterogeneous; but later in the established cell line, the predominant cell type was epithelioid. Cultured cells were predominantly diploid (2n=6); however, chromosome abnormalities were observed in a small proportion of the cells in later passages. C and G band patterns were also determined in the karyotype. The cell line isozyme profiles coincided with pupae and adult samples of the species taken from the same colony. A preliminary arbovirus susceptibility study for the cell line was undertaken. No evidence was observed of contamination of the cell line with bacteria, fungi or mycoplasma

The application of ethanol-extracted Gloriosa superba for metaphase chromosome preparation in mosquitos.

The application of ethanol-extracted Gloriosa superba for metaphase chromosome preparation in adult and 4th larva Aedes aegypti revealed that 0.5-8% ethanol-extracted Gl. superba solution could be used instead of 1% colchicine in Hanks' balanced salt solution. For adult mosquitos, the metaphase rates and average number of metaphase chromosomes per positive mosquito after intrathoracic inoculation with 1-2% ethanol-extracted Gl. superba solution were 100% and 11.8 (2-16) -12.6 (3-28) in females, and 80-90% and 16.5 (1-52) - 29.89 (1-72) in males, whereas the inoculation with 1% colchicine solution yielded 80% and 50% metaphase rates, and 18.25 (1-40) and 16.5 (2-53) average number of metaphase chromosomes per positive mosquito in females and males, respectively. For 4th stage larvae, the metaphase rates and average number of metaphase chromosomes per positive mosquito after incubation with 0.5-8% ethanol-extracted Gl. superba solution were 90-100% and 14.42 (1-65) - 64 (19-137), while incubation with 1% colchicine solution yield 100% metaphase rate and 10.9 (7-15) average number of metaphase chromosomes per positive mosquito.